Xác định mầm bệnh vi bào tử trùng (Microsporidia) nhiễm trong cơ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus

Cá tra (P. hypophthalmus) là một trong những đối tượng thủy sản được nuôi phổ biến và có giá trị kinh tế ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Quá trình nuôi cá tra cũng thường xuyên gặp trở ngại về bệnh. Trong đó, vi bào tử trùng Microsporidia có thể gây thiệt hại về kinh tế cho nghề nuôi cá tra.

Thực tế cho thấy bệnh do vi bào tử trùng nhiễm trong cơ cá tra ở dạng bào nang hình tròn hoặc bầu dục, màu trắng sữa nên còn được gọi là bệnh “gạo”. Bệnh không làm cho cá chết nhưng làm cá gầy yếu, giảm giá trị thương phẩm và sản phẩm thịt cá không tiêu thụ được.

Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy bệnh gạo thường xuất hiện trong các ao nuôi cá tra từ giai đoạn cá giống đến giai đoạn nuôi cá thịt, bệnh gạo xuất hiện quanh năm, không theo mùa vụ (Nguyễn Thị Thu Hằng và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011). Kết quả nghiên cứu của một số tác giả nước ngoài ghi nhận vi bào tử trùng Microsporidia ký sinh trong tổ chức cơ quan của cá thường có dạng bào nang màu trắng sữa. Một số loài có khả năng kích thích làm tế bào nhiễm bệnh trương to. Lúc cá nhiễm nặng có thể nhìn thấy rõ các bào nang rất lớn trên thân cá (Lom and Dykova, 1992; Keeling and Slamovits, 2004; Rodriguez- Tovar, 2004). Hiện nay, các phương pháp thường được sử dụng như soi tươi, nhuộm mẫu, cắt mô cũng được thực hiện để chẩn đoán nhanh cá bị nhiễm vi bào tử trùng Microsporidia (Woo, 2006; Anane and Attouchi, 2010). Bên cạnh đó, phương pháp realtime PCR và multiplex PCR cũng đang được ứng dụng rộng rãi để phát hiện Microsporidia nhiễm trên cá (Castillon et al., 2000; Sokolova et al., 2004; Mansour et al., 2005; Ghost and Weiss, 2009).

Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu về đặc điểm bệnh học của vi bào tử trùng gây bệnh gạo trên cá tra nuôi ở ĐBSCL. Vì vậy, nghiên cứu “Xác định mầm bệnh vi bào tử trùng (Microsporidia) nhiễm trong cơ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là cần thiết để làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về bệnh gạo trên cá tra.

Phương pháp thu và bảo quản mẫu

Thu mẫu được tiến hành từ tháng 4/2013 đến tháng 11/2014 tại 3 tỉnh An Giang (AG), Cần Thơ (CT) và Vĩnh Long (VL). Mỗi địa điểm thu 5 ao cá giống, 2-3 ao cá thịt. Chọn các ao cá nhiễm bệnh gạo, thu ngẫu nhiên 30 con/ao cá giống và 15 con/ao cá thịt. Riêng ở Cần Thơ thu 1 ao cá hương nhiễm gạo. Thu mẫu cá còn sống hoặc vừa mới chết, tiến hành tách (phi lê) cơ cá, dùng dao cắt phần cơ bị nhiễm bào nang gạo cho vào dung dịch Formol trung tính 10%, sau 24 giờ tiến hành rửa mẫu cho đến hết formol thì chuyển sang trữ trong cồn 70% cho đến khi phân tích mô học. Trên cùng mẫu cá bệnh, một số phần cơ khác có bào nang gạo và không có bào nang gạo được trữ trong ethanol 100% để chiết tách DNA dùng cho phân tích PCR.

Kết quả nghiên cứu

- Dấu hiệu bệnh lý

Quan sát dấu hiệu lâm sàng của 578 mẫu cá tra thấy có sự khác biệt giữa 3 nhóm cá hương (30 mẫu), cá giống (428 mẫu) và cá thịt (120 mẫu). Cơ thịt cá ở giai đoạn cá hương có kích thước nhỏ, trong suốt nên có thể nhìn thấy rõ các bào nang gạo màu trắng sữa rất to ký sinh bên trong (Hình 1A). Khi tách lớp cơ, các bào nang có lớp màng bao khá ổn định, không bị vỡ (Hình 1B). Giai đoạn cá giống và cá thịt nhiễm vi bào tử trùng, một số trường hợp trên da cá xuất hiện những vết nhỏ li ti (Hình 1C), hoặc có một vài đến rất nhiều vết hoại tử tròn lõm sâu vào trong cơ của cá.

Sau khi tách phần cơ của cá, hầu hết các bào nang tồn tại trong cơ dưới dạng những túi tròn hoặc hình thoi hoặc những vệt dài, bên trong chứa chất lỏng màu trắng sữa, đôi khi có màu hơi vàng, với đường kính bào nang từ 2-9 mm. Đặc biệt, ở một số mẫu cá nhiễm bào nang bệnh gạo nặng, các bào nang hình hạt gạo này từ màu trắng sữa sẽ chuyển sang màu nâu hoặc ở giữa bào nang gạo có chấm màu đen nhỏ, sau đó màu đen lan rộng dần hết bào nang. Các bào nang thường có xu hướng tập trung nhiều ở phần cơ gần lớp da của cá.

Hình 1: A&B: cá hương nhiễm gạo; C&D: Cá thịt nhiễm gạo có nhiều lổ thủng trên da

Ở những ao cá thịt nhiễm vi bào tử trùng Microsporidia trong thời gian dài, các bào nang gạo chuyển sang màu vàng, đông vón lại và vẫn nằm trong cơ cá. Các bào nang này có thể được tách ra khỏi phần cơ của cá. Hoặc những mẫu cá bị dị hình cũng nhiễm vi bào tử trùng Microsporidia.

Hình 2: A: Cá thịt nhiễm gạo nâu; B: Cá thịt nhiễm gạo đen; C&D: Cá thịt nhiễm gạo, gạo bị sơ cứng thành mảng

Kết quả quan sát dấu hiệu bệnh lý về cá tra bệnh gạo Nguyễn Thị Thu Hằng và Đặng Thị Hoàng Oanh (2011, 2012), các mẫu nhiễm gạo thu từ thời điểm tháng 4/2013 đến tháng 11/2014 có những dấu hiệu đặc trưng hơn như trên da cá có nhiều thương tổn, xuất hiện những lổ tròn từ nhỏ đến rất to (không phải là dấu hiệu lở loét) kèm xuất huyết, bên trong bào nang gạo (kích cỡ 2-9 mm) là chất dịch đặc có màu trắng sữa hoặc hơi vàng kem. Một số bào nang có vệt màu vàng, sau chuyển dần sang màu đen.

- Tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm

Bằng phương pháp soi tươi, kết quả phân tích 578 mẫu cá ở Cần Thơ, An Giang và Vĩnh Long đã phát hiện 473 mẫu nhiễm vi bào tử trùng Microsporidia. Trong đó, kiểm tra 30 mẫu cá hương thu ở Cần Thơ cho thấy có đến 28 mẫu nhiễm bào nang gạo, tỉ lệ nhiễm chiếm 93,3%, cường độ nhiễm dao động từ 2-14 bào nang/cá.

Ở cả 3 tỉnh, mẫu cá giống luôn có tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm cao hơn cá thịt. Tỉ lệ nhiễm trên cá giống ở Cần Thơ từ 70-83,3%, cường độ nhiễm dao động từ 1-181 bào nang/cá, cá giống ở An Giang có tỉ lệ nhiễm khá cao, chiếm từ 86,6-96,6% và cường độ nhiễm từ 1-160 bào nang/cá. Mẫu cá ở Vĩnh Long có tỉ lệ nhiễm 73,3-93,3% và cường độ nhiễm từ 1-83 bào nang/cá. Đối với cá thịt, tỉ lệ nhiễm trên mẫu ở Cần Thơ từ 66,6-80%, cường độ nhiễm từ 1-70 bào nang/cá. Tỉ lệ nhiễm trên mẫu cá ở An Giang chiếm từ 46,6-86,6% và cường độ nhiễm từ 1-44 bào nang/cá. Mẫu cá ở Vĩnh Long có tỉ lệ nhiễm từ 40-73,3% và cường độ nhiễm từ 1-76 bào nang/cá.

Nhìn chung, tỉ lệ nhiễm ở các ao cá giống dao động từ 70-96,6% và cường độ nhiễm từ 1 -181 bào nang/cá. Trên cá nuôi thương phẩm, tỉ lệ nhiễm ở các ao thấp nhất là 40%, cao nhất là 86,6%; cường độ nhiễm từ 1-76 bào nang/cá. Không có sự khác biệt mức độ nhiễm gạo theo vùng nuôi ở An Giang, Cần Thơ và Vĩnh Long. Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm vi bào tử trùng Microsporidia nhiễm trong cơ cá tra khá cao, điều này là do đề tài không thu mẫu ngẫu niên mà chỉ tập trung thu mẫu ở những ao đã nhiễm bệnh gạo, vì vậy mức độ nhiễm cao hơn kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hằng và Đặng Thị Hoàng Oanh (2011). Theo đó, nghiên cứu này ghi nhận tỷ lệ nhiễm chỉ dao động từ 40-85,7% và cường độ nhiễm từ 0-9 bào nang/cá.

- Kết quả định danh vi bào tử trùng

Kết quả quan sát tiêu bản tươi cho thấy các bào tử có cấu tạo bên ngoài dạng hình quả lê hoặc hình trứng, hơi thon nhỏ ở cả 2 đầu. Các bào tử này có kích thước rất nhỏ, nhỏ hơn gần 10 lần so với kích thước của các loài vi bào tử trùng khác. Bên trong có thể quan sát thấy 1 sợi cực dạng xoắn nối liền với 1 cực nang ở phần sau của bào tử. Số vòng xoắn của sợi cực khá nhiều nên rất khó phân biệt được sợi cực khi quan sát ở cùng một thị trường kính hiển vi. Ngoài ra, bên dưới sợi cực có không bào với kích thước nhỏ. Quan sát tiêu bản nhuộm Giemsa ở vật kính 40X nhận thấy phần cực nang của các bào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm Giemsa.

Nhìn chung, qua kết quả soi tươi, dựa vào khóa phân loại và mô tả của Lom and Dykova (1992), Woo (2006) và Barber et al. (2009) có thể xác định vi bào tử trùng ký sinh trong bào nang gạo ở cơ các tra thuộc giống vi bào tử trùng Kabatana.

- Kết quả phân tích PCR và giải trình tự gen

Mười hai mẫu cơ cá tra (gồm cá hương, cá giống và cá thịt) có nhiễm và không nhiễm bào nang gạo được chọn ngẫu nhiên để phân tích PCR. Mẫu được chiết tách DNA và phân tích PCR sử dụng mồi HG4F và HG4R đặc hiệu cho Microsporidia. Tổng cộng có 9 mẫu chứa bào nang gạo ở các giếng 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14 và 3 mẫu ở vùng cơ không chứa bào nang gạo (các giếng 10, 11, 12).

Hình 3: Kết quả điện di qui trình phát hiện Microsporidia

Kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 3) cho thấy 9 mẫu chứa bào nang cho kết quả dương tính và hiện vạch ở vị trí 1100 bp. Trong khi đó, mẫu 10 (CT-T-A4-M25) và mẫu 11 (VL-T-A4-M9) có hiện vạch rất mờ ở vị trí 1100bp và mẫu 12 (VL-T-A5-M1) cho kết quả PCR âm tính (không hiện vạch).

Kết quả PCR ở 2 giếng 10 và 11 là mẫu cơ không có bào nang gạo, tuy nhiên, vẫn có vạch hiện ở vị trí 1100 bp khá mờ, điều này cho thấy có lẽ trong mẫu cơ vẫn có vi bào tử Microsporidia ký sinh ở mật độ rất thấp.

Kết luận

Giai đoạn cá hương và cá giống có tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn giai đoạn cá thịt. Tỷ lệ nhiễm trên ao cá hương là 93,3%, trên cá giống thấp nhất là 70% và cao nhất là 96,6%. Đối với cá nuôi thịt thì tỉ lệ nhiễm từ 40 -73,3%. Cường độ nhiễm ở cá hương dao động từ 2-14 bào nang/cá, ở cá giống từ 1-160 bào nang/cá và cá thịt từ 1-83 bào nang/cá. Mô học: Vùng cơ của cá tra nhiễm bào nang gạo bị mất cấu trúc và hoại tử, các tế bào mô bị vi bào tử trùng Mirosporidia ly giải hoàn toàn. Một số vùng cơ xuất hiện bào nang tiên khởi. Quan sát đặc điểm hình thái kết hợp với so sánh trình tự gen từ sản phẩm PCR có kích thước là 1100 bp đã xác định vi bào tử Kabatana sp. nhiễm trong cơ cá tra.

Nguồn Nguyễn Thị Thu Hằng và Đặng Thị Hoàng Oanh. Tạp chı́ Khoa học, Trường Đại học CầnThơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 42 (2016): 101-110